农药降解基因工程菌的构建及其应用中的生物安全性控制
  • 【摘要】

    从化工厂废水处理池的活性污泥中分离到了一株高效的对硝基苯酚降解菌,命名为LZ-1.根据菌株的表型特征、16S rRNA基因序列相似性和生理生化特性,将菌株LZ-1初步鉴定为寡氧单胞菌.菌株LZ-1能利用对硝基苯酚作为唯一的碳源和氮源进行生长,此外也能利用其它对位取代酚如对氯苯酚作为唯一的碳源进行生长.菌株LZ-1通过对苯二酚途径将这些酚完全降解.菌株LZ-1可以对对硝基苯酚和对氯苯酚的混合物进行共... 展开>>从化工厂废水处理池的活性污泥中分离到了一株高效的对硝基苯酚降解菌,命名为LZ-1.根据菌株的表型特征、16S rRNA基因序列相似性和生理生化特性,将菌株LZ-1初步鉴定为寡氧单胞菌.菌株LZ-1能利用对硝基苯酚作为唯一的碳源和氮源进行生长,此外也能利用其它对位取代酚如对氯苯酚作为唯一的碳源进行生长.菌株LZ-1通过对苯二酚途径将这些酚完全降解.菌株LZ-1可以对对硝基苯酚和对氯苯酚的混合物进行共降解,并且对氯苯酚的存在可以明显加快菌株LZ-1对对硝基苯酚的降解,这是首次对PNP和4-CP共降解的微生物的报道.与未接种菌株LZ-1的土壤相比,将菌株LZ-1以106 cell/g土壤的密度接种到含100 mg/kg对硝基苯酚和对氯苯酚的土壤中,能够快速地降解土壤中的这两种酚.在一个较宽的温度范围内(4 °C-35 °C),菌株LZ-1降解上述酚类的能力仍然存在.这些结果表明,菌株LZ-1在对受到酚类污染土壤的生物修复中有非常好的应用潜能. 利用丁香假单胞菌的外膜蛋白-冰成核蛋白的N端和C端结构域(INPNC)作为表面锚定模序,首次将有机磷水解酶(OPH)在我们分离到的寡氧单胞菌LZ-1的细胞表面表达,从而消除了细胞外膜的渗透屏障效应.蛋白酶消化和细胞分级实验表明,90%以上的OPH活性存在于重组菌的细胞表面.Western免疫印迹和免疫荧光分析实验,进一步证明了INPNC-OPH融合蛋白在细胞表面的定位.工程菌LZ-1能够迅速地降解有机磷农药及其水解产物-对硝基苯酚,而且没有细胞的生长抑制.添加对氯苯酚(低于0.8 mM)能够通过加速对硝基苯酚的降解来显著地加快整个农药的降解过程(对氧磷、对硫磷和甲基对硫磷的完全降解时间分别缩短了47.1%、34.0%、40%).将异源功能蛋白在天然菌的表面进行表达,是一种对污染环境进行生物治理的有价值的技术. 随着基因工程技术及生物技术的快速发展,使用基因工程菌进行杀虫剂的原位降解修复具有现实意义.然而,这些基因工程菌所含的重组DNA在环境中的土著菌群中的扩散和水平转移问题有着潜在的风险.目前,使用致死基因进行生物安全性控制的研究较为成熟.本研究中,我们将甲基对硫磷水解酶基因(mpd)及相应的严紧调节型启动子引入天然的有机氯农药六六六(γ-HCH)降解菌Sphingomonas paucimobilis UT26中,构建一株能够同时降解甲基对硫磷和六六六的工程菌.出于对其环境释放的生物安全性的考虑,我们设计了以DNA和细胞膜为自杀作用靶标物质的独立的条件性双自杀系统,征募了gef和ecoRIR两种致死基因,采用TOL质粒的苯甲酸盐特异性启动子Pm以及该启动子的调控因子XylS作为启动细胞死亡基因的调控元件,通过廉价无毒的苯甲酸盐进行诱导,实现菌体破裂及DNA的消除.为了实现上述功能基因的遗传稳定性,我们利用能广泛适用于革兰氏阴性菌的mini-Tn5转座子系统,将mpd基因和双自杀系统均插入Sphingomonas paucimobilis UT26的染色体上,使得该基因工程菌于环境使用中有效降解农药残留的同时,具备良好的生物安全性控制能力. 收起<<

  • 【作者】

    刘正 

  • 【学科专业】

    生物化学与分子生物学

  • 【授予学位】

    博士

  • 【授予单位】

    中国科学院动物研究所

  • 【导师姓名】

    乔传令

  • 【学位年度】

    2009

  • 【语种】

    chi

  • 【关键词】

    生物整治%有机磷农药%有机氯农药%对硝基苯酚%对氯苯酚%共降解%有机磷水解酶%融合蛋白%表面表达%冰成核蛋白%基因工程微生物%致死基因%转座子%双自杀